شناسایی ساختار مولکولی پروتئین غشاء تیلریا آنولاتا

 مقدمه و هدف: تشخیص متداول دو بیماری تیلریوز و بابزیوز در ایران بر اساس رنگ آمیزی گسترش ها ی خونی دامهای مشکوک با رنگ گیمسا می باشد. این نوع رنگ آمیزی بعنوان یک روش ساده ، ارزان و قابل استفاده در تمام آزمایشگاهها مطرح می باشد. اما از آنجایی که این رنگ آمیزی غیر اختصاصی است لذا تشخیص و تفکیک جنس و گونه اجرام انگلی بسیار مشکل و نیاز مند تجربه تخصصی بالا می باشد. برای مثال در بعضی موارد بعلت تشابه زیاد اجرام مختلف مانند بابزیا اویس و تیلریا لستوکاردی تمایز این دو جنس حتی برای افراد مجرب نیز می تواند مشکل ساز باشد. اخیرا در انسان گونه جدیدی از انگل های پیروپلاسمایی تحت عنوان WA1 مورد شناسایی قرار گرفته که از نظر ریخت شناسی با بابزیا میکروتی مشابه بوده اما از نظر بیولوژیکی و ژنتیکی از آن متفاوت و مشابه عوامل بیماریزای بابزیا ژیبسونی و حتی گونه های تیلریا نسبت به سایر اعضاء جنسهای بابزیا می باشد. جنس و گونه مذکور با استفاده از رنگ آمیزی با گیمسا ، قابل تفکیک نمی باشد در حالی که با استفاده از پادتن های اختصاصی قابل تفکیک و شناسایی می باشند. روش دیگری که برای تشخیص از مزایای بالایی برخوردار می باشد، روش تکثیر مکرر DNA (PCR) است. به منظور در اختیار داشتن آنتی ژن اختصاصی که توالی نوکلئوتیدی آن بتواند در امر تشخیص به روش PCR مورد استفاده قرار گیرد و همچنین توالی اسیدهای آمینه آن بتواند جهت ایمن سازی و تولید پادتن های اختصاصی مورد استفاده قرار گیرد، ژن پروتئین غشاء تیلریا آنولاتا (TaSp) در وکتور بیانی pQE-32 کلون گردید. مواد و روش کار: پس از استخراج mRNA از عقده لنفاوی و تولید cDNA، cDNA تولید شده با روش SMART-PCR مورد تکثیر قرار گرفت. سپس با آغازگرهای اختصاصی برای ژن غشاء تیلریا آنولاتا (TaSp)، cDNA این ژن تکثیر داده شد و در وکتور بیانی pQE-32 کلون و مورد تعیین توالی قرار گرفت. در پایان پروتیئن نوترکیب تولید و با روش Western blotting مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج وبحث: پس از استخراج RNA و تولید cDNA، توالی نوکلئوتیدی ژن TaSp با استفاده از روش RT-PCR تکثیر داده شد و در وکتور بیانی pQE-32 کلون و تعیین توالی گردید. با توجه به وجود ایزوله های مختلف در مناطق جغرافیایی و نیز تشابه عفونت ایجادشده توسط تیلریا لستوکاردی در گوسفند به تیلریا آنولاتا در گاو، در این مطالعه پس از تهیه توالی کد کننده پروتئین سطحی انگل تیلریا آنولاتا در ایزوله جدا شده از منطقه محمدشهر در حومه کرج، با شش توالی ثبت شده در بانک ژنتیک و همچنین توالی کد کننده پروتئین سطحی در تیلریا لستوکاردی مربوط به ایزوله فارس مورد مقایسه قرار گرفت. بیشترین تفاوت در توالی نوکلئوتیدی ناحیه کد کننده انتهای آمینی پروتئین سطحی در ایزوله مورد مطالعه(JQ003240) و توالی های تیلریا آنولاتا ایزوله آنکارا(AJ316249.1)، تیلریا چین 1 (AY274329.1)، تیلریا چین (DQ120058.1) و سه توالی ثبت شده در بانک ژنتیک مربوط به ایزوله های کرج (EF092920.1)، بوئین زهرا 1 (EF092921.1) و بوئین زهرا 2 (EF092922.1) دیده شد و مهمترین نکته مشاهده 12 نوکلئوتید از موقعیت نوکلئوتید شماره 66 تا 78 (نوکلئوتید شماره 378 از نوکلئوتید ابتدایی در توالی کامل نوکلئوتیدی کد کننده پروتئین سطحی تا نوکلئوتید شماره 390)بود که این 12 نوکلئوتید تنها در توالی ایزوله مورد بررسی (JQ003240) دیده شدند و در هیچ یک از شش توالی مورد مقایسه مشاهده نشد. همچنین توالی مورد مطالعه دارای 90% مشابهت نوکلئوتیدی با توالی مربوط به تیلریا لستوکاردی ایزوله فارس (AY274335.1) بود. پس از تهیه ردیف مقایسه ای نوکلئوتیدی ایزوله های مختلف، یک جفت پرایمر طراحی شد که تنها با استفاده از یک واکنش PCR بر روی نمونه DNA اخذ شده، با استفاده از تفاوت در توالی ژن پروتئین سطحی می توان در سطح گونه آلودگی به تیلریا به راحتی مورد تشخیص قرار گیرد.